微生物胞内多聚磷酸盐（Polyphosphate, polyP）的合成和累积对于污水中磷的生物去除以防治湖泊、水库等受纳水体的富营养化至关重要。鉴于polyP由多聚磷酸盐激酶（Polyphosphate kinase 1, PPK1）催化合成，通过基因工程手段过表达PPK1能够提高宿主菌胞内polyP的含量。为实现这一目标，高拷贝质粒往往被用作过表达PPK1的载体，因为传统基因工程理念认为更多的酶往往意味着更多的酶催化产物。然而，多数基因工程菌的polyP含量往往低于理论预期值100-200 mg-P/g-DW。在这种情况下，低产的原因会被归结为涉及polyP合成通路的相关代谢流（如磷酸盐向胞内的转运）不足，因而第二个质粒会被同时引入同一个宿主菌来强化相关的辅助代谢通路，从而形成了“双质粒策略”（Dual Plasmid Strategy）（图1）。即便如此，最终结果也往往适得其反。
我院杨柳燕教授课题组从代谢工程学（Metabolic Engineering）和合成生物学（Synthetic Biology）的角度对过去30年的相关研究做了聚类分析，指出polyP的生物合成有其特殊性—该过程以ATP为底物，而ATP作为一种“能量流”（Energy Currency）在宿主细胞生命的任何阶段都是有限的。在高拷贝质粒策略和双质粒策略中，polyP低产的症结在于质粒的复制、质粒编码基因的转录以及质粒编码蛋白的合成过程本身将消耗大量的ATP，因而即使大量的PPK1被合成，也将因缺乏底物ATP而无法实现polyP的高产。因此，在能量流有限的前提下要实现polyP产量的最大化，研究者需要权衡花费多少ATP用于酶的过表达以及预留多少ATP留作酶反应的底物。基于这样一种理念，杨柳燕教授课题组提出了一种简单高效的polyP合成策略—“单中等拷贝质粒策略”（Solo Medium-copy Plasmid Strategy），即在宿主细胞中仅采用一个中等拷贝质粒表达PPK1，即可实现ATP在酶的过表达和底物存留间的平衡分配，进而实现polyP产量的最大化（图2）。同时，单一的中等拷贝质粒不会给宿主细胞带来显见的生长代谢负担，因而决定生物除磷绝对量另一个重要指标—生物量也得到了保障。基于该策略所构建的弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）基因工程菌能够将合成废水中的磷完全去除并以polyP的形式将其浓缩在胞内（图1）。
图1.（上）两类基因工程策略原理示意图（下）基于Solo Medium-copy Plasmid Strategy构建的基因工程菌好氧一步法除磷应用示意图
图2.（a）C.freundii野生型及基因工程菌胞内polyP颗粒随时间变化的光学显微镜照片（改良Albert染色法）；（b）15h时C.freundii野生型及基因工程菌胞内polyP颗粒及菌体形态的激光共聚焦显微镜照片（DAPI染色法）
这一研究成果近日在线发表于环境学科国际权威期刊Environmental Science & Technology (DOI: 10.1021/acs.est.7b04532)，论文第一作者为王鑫博士研究生，通讯作者为杨柳燕教授。该研究得到国家水体污染控制与治理重大专项基金（2017ZX07204）的资助。
